技術(shù)文章
Technical articlesELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡(jiǎn)稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來(lái)的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來(lái),發(fā)展十分迅速,目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。在臨床檢驗(yàn)中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。
ELISA免疫測(cè)定目的是?
1.測(cè)定體液中的各種蛋白質(zhì),包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等;
2.測(cè)定激素,包括小分子量的甾體激素等;
3.測(cè)定抗生素和藥物;
4.測(cè)定病原體抗原,HBsAg、HBeAg等;
5.利用純化的抗原檢測(cè)標(biāo)本中的抗體,例如抗-HBs等;
ELISA免疫測(cè)定原理
①使抗原(或抗體)結(jié)合到某種固相載體表面,并保持其免疫活性;
②使抗原(或抗體)與某種酶聯(lián)結(jié)成酶標(biāo) 抗原(或抗體),而且此酶標(biāo)抗原(或抗體)既保留其免疫活性,又保留其酶活性;
③測(cè)定時(shí)將受檢標(biāo)本(抗體或抗原)和酶標(biāo)抗原(或 抗體)按不同步驟與固相載體表面的抗原或抗體進(jìn)行反應(yīng),再用洗滌方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其它物質(zhì)分開,后結(jié)合 在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢的抗體或抗原量成比例;再加入酶反應(yīng)底物后,底物被酶催化后變?yōu)橛猩a(chǎn)物,根據(jù)其顏色反應(yīng)的 深淺進(jìn)行定性或定量分析,以了解被測(cè)標(biāo)本中抗體或抗原含量。
ELISA免疫測(cè)定步驟
1. 包被;
2. 加樣:加稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時(shí)。然后洗滌(同時(shí)做空白孔,陰性對(duì)照孔及陽(yáng)性對(duì)照孔);
3. 加酶標(biāo)抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時(shí),洗滌。
4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘;
5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml;
6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽(yáng)性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無(wú)色或極淺。也可測(cè)OD值:在ELISA檢測(cè)儀上,于450nm處,以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值。
ELISA免疫測(cè)定流程圖
ELISA免疫測(cè)定流程圖