技術(shù)文章
Technical articles大家一直都覺得ceRNA的研究,就是研究LncRNA的簡便機制了是吧。因為都不用來論證啥,就直接證明LncRNA和對應(yīng)的mRNA能同時結(jié)合miRNA就行了,不是么?
其實,也不全是,當(dāng)然,要是把ceRNA作為低分的LncRNA研究機制的話,那簡單的就是做一個Luciferase實驗:
也就是利用Luciferase的3'UTR結(jié)合miRNA,來驗證一下lncRNA和mRNA是不是分別能和miRNA結(jié)合。這個都是研究miRNA的基本套路。
但LncRNA并不會表達蛋白,所以用Luciferase的方法,并不靠譜。所以就需要通過別的實驗來驗證。
用于ceRNA研究的常用的方法還有MS2-RIP,就是體外過表達LncRNA的時候,在末端接上一個MS2蛋白結(jié)合的串聯(lián)序列,然后用MS2蛋白用RNA免疫共沉淀(RIP)的方法拉下來。當(dāng)然LncRNA上會帶有結(jié)合的miRNA,把拉下來的miRNA做real-time PCR就可以了。
當(dāng)然,類似的方法,還有用生物素標(biāo)記LncRNA的RIP,同樣也是將LncRNA拉下來,然后再通過Real-time PCR來看結(jié)合上去的miRNA的表達。
其實這兩種方法,都有異曲同工的作用,就是驗證LncRNA與miRNA的結(jié)合。但是這兩種方法,其實也不能解釋mRNA是否能與LncRNA形成ceRNA的關(guān)系。于是就產(chǎn)生了這樣的方法:
由于miRNA形成RISC復(fù)合體結(jié)合的時候,是被AGO蛋白包裹的,主要是AGO2。也就是說,拉下AGO2蛋白,就能拉下結(jié)合在上面的miRNA,這樣RISC結(jié)合的LncRNA以及mRNA也會被拉下來。這就是AGO2-RIP,也就是通過拉miRNA,來分析miRNA結(jié)合的LncRNA以及mRNA的量:
用這種方法,可以相對直接地研究ceRNA之間的關(guān)系。當(dāng)然,在較高分的ceRNA的研究中,這種方法也是被經(jīng)常用到的。