Co-ip染色質(zhì)免疫共沉淀準(zhǔn)備工作:
1. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次,后一次吸干PBS;
2. Co-ip染色質(zhì)免疫共沉淀加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1ml/107個(gè)細(xì)胞、10cm培養(yǎng)皿或150cm2培養(yǎng)瓶,0.5ml/5×106個(gè)細(xì)胞、6cm培養(yǎng)皿、75cm2培養(yǎng)瓶)
3. Co-ip染色質(zhì)免疫共沉淀用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下,把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中,4℃,緩慢晃動(dòng)15min(EP管插冰上,置水平搖床上)
4. 4℃,14000g離心15min,立即將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中
5. 準(zhǔn)備Protein A agarose,用PBS 洗兩遍珠子,然后用PBS配制成50%濃度,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠(50%),4℃搖晃10min(EP管插冰上,置水平搖床上),以去除非特異性雜蛋白,降低背景
7. 4℃,14000g離心15min,將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中,去除Protein A珠子
8. (Bradford 法)做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),測(cè)定蛋白濃度,測(cè)前將總蛋白至少稀釋1:10倍以上,以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響(定量,分裝后,可以在-20℃保存一個(gè)月)
9. Co-ip染色質(zhì)免疫共沉淀用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl,以降低裂解液中去垢劑的濃度,如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低,則總蛋白濃度應(yīng)該稍高(如10 μg/μl)
10. 加入體積的兔抗到500μl總蛋白中,抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異
11. 4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來(lái)捕捉抗原抗體復(fù)合物,4℃緩慢搖動(dòng)抗原抗體混合物過(guò)夜或室溫1h,如果所用抗體為鼠抗或雞抗,建議加2 μl"過(guò)渡抗體"(兔抗鼠IgG,兔抗雞IgG)
13. 14000rpm瞬時(shí)離心5s,收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物,去上清,用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有時(shí)候會(huì)破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合,可以使用PBS
14. Co-ip染色質(zhì)免疫共沉淀用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起,輕輕混勻,緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道)
15. 將上樣樣品煮5min,以游離抗原,抗體,珠子,離心,將上清電泳,收集剩余瓊脂糖珠,上清也可以暫時(shí)凍-20℃,留待以后電泳,電泳前應(yīng)再次煮5min變性。